Šta je ekstracelularna DNK?
U krvnoj plazmi trudnice nalazi se njena vanćelijska DNK, ali i vanćelijska DNK deteta. To su kratki molekuli DNK koji se oslobađaju u krvnu plazmu kao rezultat apoptoze (programirana smrt ćelije). Ekstracelularna DNK majke potiče od degradiranih masnih ćelija i leukocita, a fetalna DNK od degradiranih ćelija placente. Tokom NIPT testiranja analiziraju se obe komponente, ali za otkrivanje hromozomskih poremećaja deteta neophodna je analiza dovoljne količine ekstracelularne fetalne DNK.
Šta je fetalna frakcija i zašto je važna?
Fetalna frakcija (FF) je postotak izvanstaničnog DNK fetalnog porijekla u majčinoj krvi. Ona je jedan od najvažnijih parametara koji utječe na točnost NIPT testiranja jer ispod potrebnog minimuma FF opada točnost rezultata kod pojedinih NIPT testova tj. mogući su lažni rezultati testa.Fetalna frakcija varira između 9. i 14. tjedna trudnoće od ~2% do ~20%. Dakle, njezin postotak prvenstveno ovisi o tjednu trudnoće, ali i faktorima kao što su težina trudnice, veličina placente i je li trudnoća jednoplodna ili višeplodna.
Na fetalnu frakciju utiče i vrsta aneuploidije. Trudnoće sa Daunovim sindromom imaju veću fetalnu frakciju od prosečne, dok trudnoće sa trizomijom 18 (Edvardsov sindrom) i 13 (Patauov sindrom) imaju nižu fetalnu frakciju od očekivanog proseka. Fetalna frakcija takođe varira u zavisnosti od toga da li se radi o trudnoći sa triploidijom majke ili oca.
Uzimanje antikoagulantne terapije može uticati na smanjenje fetalne frakcije i povećati rizik od lažnih rezultata NIPT testova koji koriste metod brojanja, pa se takvi NIPT ne preporučuju. Zbog svoje sposobnosti da razlikuje fetalnu od majčine DNK, preporučuje se SNP metoda, čija tačnost ne zavisi od procenta fetalne frakcije.
Metode na kojima se zasnivaju NIPT testovi i njihov odnos prema fetalnoj frakciji Način na koji određeni NIPT test čita podatke iz fetalne DNK i njegov algoritam za izračunavanje podataka je ono što čini NIPT testove fundamentalno različitim. Sva NIPT ispitivanja na tržištu obavljaju tzv tehnologije sledeće generacije, ali koriste dve različite metode kojima su, da bi dale tačne rezultate, potrebne različite minimalne fetalne frakcije.
1. Metoda prebrojavanja
Metoda koju koristi većina testova na tržištu i čija se tačnost smanjuje ispod minimalne fetalne frakcije od 8%. Ova metoda ne razlikuje ekstracelularnu DNK trudnice od vanćelijske DNK fetusa, već se posmatra kao jedna celina. Kod malih fetalnih frakcija, rezultati analize se zapravo odnose na ekstracelularnu majčinu, umesto na ekstracelularnu fetalnu DNK. Što je manje ekstracelularne fetalne DNK, teže je otkriti fetalne hromozomske poremećaje i veća je šansa da će test dati lažni rezultat.
a) Masivno paralelno sekvenciranje (MPSS)
-
Zasnovan je na poređenju ukupne ekstracelularne DNK (i majke i fetusa) sa referentnim genomom. Korišćenjem ove metode, dokaz aneuploidije je očigledan kada postoji relativni višak (trizomija) ili deficit (monosomija) bilo kog posmatranog hromozoma u odnosu na njihov očekivani broj.
b) Mikročip (eng. microarray)
-
Stariji i najjeftiniji metod određivanja korišćenjem novog DANSR algoritma (digitalna analiza ciljnih regiona). I ovom metodom se posmatra zbir ekstracelularne DNK trudnice i fetusa, ali u poređenju sa nekim referentnim hromozomom za koji se pretpostavlja da je stabilan. Pošto je poznato koliko je jedan hromozom veći ili manji u poređenju sa drugim, promena izmerenog odnosa ukazuje na povećan rizik od hromozomske patologije.
2. SNP metoda
Metoda novije generacije čija se tačnost smanjuje samo ispod minimalne fetalne frakcije od 2,8%. Metodom SNP (eng. single nucleotide polimorphism) ciljano se sekvenciraju polimorfni regioni, odnosno promene pojedinačnih nukleotida (SNP), pri čemu se utvrđuje koji se SNP-ovi odnose na trudnicu, a koji na fetus. Za razliku od metode brojanja, SNP metoda se zasniva na poređenju specifičnih genotipova trudnice i fetusa. Kako je SNP metoda jedina koja razlikuje ekstracelularnu DNK majke od vanćelijske DNK deteta, ona obezbeđuje najmanji broj lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata. Panorama test koristi ovaj metod, što ga čini najtačnijim testom na tržištu.
Uzroci lažnih rezultata drugih prenatalnih testova
- Uzroci lažno pozitivnih rezultata:
Neidentifikovani nestali blizanac
Placentalni mozaicizam
Mozaicizam polnih hromozoma trudnice CNV – varijacije broja kopija kod trudnice
Mogući tumori trudnice
Transplantacija Nedostatak studije validacije
- Uzroci lažno negativnih rezultata:
Neidentifikovani nestali blizanac
Niska fetalna frakcija
Triploidija
Potpuna molarna trudnoća
Placentalni mozaicizam CNV – varijacije broja kopija kod trudnice
Tvin trudnoća
Nedostatak studije validacije
Zahvaljujući svojoj tehnologiji, Panorama izbegava gore pomenute lažne rezultate.